VIỆN QUỐC GIA ĐỊNH CHUẨN VNCH: December 2018

DỤNG CỤ CRISPR-Cas9 CẮT NỐI DNA CỦA SINH VẬT

I-CRISPR-Cas9 (đọc "crisper") là chữ viết tắt của câu “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats” diễn tả hình thức sắp xếp DNA sequences của 50% vi khuẩn (50% bacteria) và 90% vi khuẫn cỗ ( 90% archae).

Các nucleotides trong DNA của vi khuẩn sắp xếp theo khoảng cách bằng nhau và lặp lại đều đặng. Ở giửa 2 nucleotides có một khỏang trống (spacer) bằng nhau.

HÌNH 1

Vi khuẩn là sinh vật rất nhỏ bé sinh tồn được nhờ protein do những genes của nó tạo ra ,và có hệ thống miễn nhiễm để tự bảo vệ khi bị các virus tấn công sát hại .

Nhà sinh vất học Nhật Bản Yoshizumi Ish là người đầu tiên đã tìm thấy trong DNA của vi khuẩn E.Coli có 29 nucleotide repeat sequence với 32 nucleotide spacing vào năm 1987.

Năm 2002, Ruud Jansen (Utrecht University) chọn tên Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats viết tắt CRISPR để ám chỉ vi khuẩn .

Nhưng mãi tới năm 2007, CRISPR mới được công nhận bởi Rodolphe Barrangou( Associate Professor, CRISPR Lab Lead).

Trong DNA của vi khuẩn có nhiều cas genes để tạo ra protein nhưng các khoa học gia chỉ chú trọng xử dụng cas9 protein của recombinant Streptococcus pyogenes Cas9 protein tinh lọc vì có nhiều ưu điểm hơn hết.

HÌNH 2

II- Thành phần và cách chế tạo CRISPR/Cas9

Cas9 protein tự nó thì bất động nhưng nếu kết hợp với gRNA(guide-RNA) thì cas9 protein chuyển đổi thành dạng three-dimensional structure có tính chất cắt bỏ và phá huỷ DNA của sinh thể ngoại nhập theo ý muốn của chúng ta. eo ý muốn của chúng ta..

Trong CRISPR/Cas9 chỉ co 2 thành phần là Cas9 protein và guide RNA (gRNA hoặc sgRNA). sgRNA nghĩa là single guide RNA.

HÌNH 3

1-Chế tạo Cas9 protein.

Cas9 là recombinant Streptococcus pyogenes Cas9 protein tinh lọc dùng để cắt đôi dây DNA của sinh thể ngọai nhập nhờ sgRNA dẫn tới địa điểm chúng ta muốn cắt bỏ. Nêu không có sgRNA thi Cas9 không họat động.

Cas9 protein còn được goị là Cas9 Nuclease mua từ các công ty chế tạo có bán sẳn.

2- Tự thiết kế single guide RNA (sgRNA) gồm có 20 nucleotides sequence.

sgRNA nói cho Cas9 protein biết phải cắt bỏ chổ nào trên DNA để thay thế cái gene mà chúng ta muốn có.

Đó là một dây đơn độc do chúng ta tự thiết kế gồm có 20 nucleotides goị là single guide RNA (sgRNA) dùng để bám vào chỗ DNA mà chúng ta muốn cắt bỏ. sgRNA chí có 20 bases mà thôi.

Chổ muốn cắt bỏ phải có 23 bases . Khởi đầu từ “CC” và chấm dứt trong “GG”. Xem hình 3,4 và 5

PAM site là chổ của 3 bases có tên NCC và NGG trên mỗi dây nhắm tới nhưng không có trong sgRNA. Base N là tên của base naò cũng được.

Thí dụ PAM : ACC và TGG

HÌNH 4

Muốn cho Cas9 protein của vi khuẩn S. pyogenes, cắt chính xác thì cần phải có PAM (protospacer adjacent motif) .

Nếu Cas9 protein không thấy có PAM cận kề mục tiêu trên DNA thì nó không cắt .

Đây là một thí dụ sgRNA sequence gôm có 20 nucleotides

5’ G AAC CGG TGC CTA GAG AAG G

Chúng ta có thể tự tăng thêm số nucleotides của gRNA nếu muốn cắt một đọan dài của DNA.Do đó trên hình vẽ số 3, chúng ta thấy gRNA có một đọan gấp xếp.

HÌNH 5

III - NHỮNG BƯỚC HỌAT ĐỘNG CỦA CRISPR–Cas9

· Cas9 trộn chung với gRNA

· Cas9/gRNA tìm trên DNA của sinh thể xâm nhập một khúc giống hệt với gRNA

· Cas9 cắt bỏ DNA xâm nhập.

· Tế bào tự chửa chổ bị cắt và đem nối vào chổ đó nucleotides mà chúng ta muốn thay thế .

· Tế bào có DNA sequence mới.

IV-THỰC HÀNH THÍ NGHIỆM

Mua của công ty NEW ENGLAND BIOLABS những món sgRNA (NEB #E2050), Cas9 protein(NEB #M0386S ), NEBuffer , Proteinase K(NEB #P8107S) và substrate DNA.

Làm trắc nghiệm theo hướng dẫn của nhà chế tạo như sau.

1-Pha chế 300 nM sgRNA = 300 nM sgRNA +20 µl H2O+ 3 µl NEBuffer

2-Lấy 1 µM Cas9 Nuclease, S. pyogenes (#M0386)

3-Trộn 1 và 2 với nhau rồi hấp ở nhiệt độ 25C trong 10 phút.

4-Lấy 30 nM substrate DNA có chứa chổ chúng ta muốn cắt bỏ.

5-Sau đó thực hiện như sau theo hướng dẫn của “New England Biolabs”

“Mix thoroughly and pulse-spin in a microfuge.

Incubate at 37°C for 15 minutes.

Add 1 μl of Proteinase K(NEB #P8107S) to each sample, Mix thoroughly and pulse-spin in a microfuge.

Incubate at room temperature for 10 minutes.

Proceed with fragment analysis.”

V-ÁP DỤNG CRISPR-Cas9 ĐỂ TẠO GIÔNG MỚI

1-NHIỆM VỤ CỦA GENE.

Gene là một vùng của genome.Phân tích mỗi gene thấy có 3 thành phần quan trọng là promoter, coding region và terminator có nhiệm vụ khác nhau.

1-1- Thứ nhứt là Coding region chứa đựng những hướng dẫn tạo protein (Contains the instructions for making a protein).

1-2-Thứ hai là vùng gọị là promoter lo nhiệm vụ khởi động gene mở và đóng,

Promoter có thể dài 100–1000 base pairs tìm thấy ở gần start site (TSS ) của gene .

1-3-Thứ ba là terminator có nhiệm vụ chấm dứt transcription của gene.

Ngoài ra DNA còn có :

Enhancer ở xa gene là một DNA sequence có nhiệm vụ làm gia tăng transcription của gene (Enhances transcription)

Transcription factor hoặc có tên sequence-specific DNA-binding factor là một loại protein có nhiệm vụ nối kết các DNA sequences nên nó cũng điều khiển mức độ truyền đạt transcription của gene.

Do đó promoters , enhancers và transcription factor làm nhiệm vụ điều khiển mức độ truyền đạt transcription từ DNA tới mRNA ( Regulate genetic transcription)

2-TÌM TÊN CỦA GENES Ở ĐÂU?

Thí dụ tìm genes của cây nho Vitis vinifera .

Tên và vị trí của các genes (trong chromosomes) gom góp từ nhiều kết quả nghiên cứu của các chuyên viên môn sinh học từ xưa tới nay được tồn trử tại :

2-1-NCBI ( National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).

2-2- Ensembl (www.ensembl.org).

2-3- UCSC.

Theo kết quả nghiên cứu cho biết gene nằm bên cạnh PAM. Vậy chổ nào có PAM thì bên cạnh có gene.

Cây nho có tên khoa học là Vitis vinifera hiện nay được trồng nhiều nhất vì lợi ích kinh tế, có genome dài khoảng 500 Mbp(Million base pairs), chứa khoảng 26,346 genes.Mỗi gene dài trung bình 3,6 base pairs

Nhóm nghiên cứu trong Website https://bmcplantbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12870-016...

cho biết :

“Trong cây nho có 5 loại PAM : TGG, AGG, GGG, CGG và NGG.

Bốn loại PAM TGG, AGG, GGG và CGG đều có trong tất cả các chromosomes của cây nho nhưng TGG xuất hiên nhiều nhất.”

Harvard University có phổ biến một website software giúp chúng ta tìm PAM có tên là https://igtrcn.org/chopchop-v2-improved-online-crisprcas9-target.

3-PHƯƠNG PHÁP THAY ĐỔI GENE TẠO RA THÂN CÂY GMO(Genetically Modified Organisms)..

Sau khi hiểu rỏ thành phần cấu tạo và nhiệm vụ của gene, nhà nghiên cứu tự lựa chọn phương pháp làm thay đổi gene.

Nhứng cây được tạo ra do thay đổi gene theo ý muốn của chúng ta được gọi cây GMO(Genetically Modified Organisms).

Tại sao cần có những cây GMO?

Cây GMO có nhiều ưu điểm như chống lại sự phá hại của côn trùng, cho năng xuất cao, chịu đựng được khô hạn ,không cần thuỗc sát trùng nên tránh ô nhiểm môi trường, tiết kiệm phí tổn trồng trọt ,binh thân cây không xuất hiện, phẫm chất dinh dưởng cao,rất tiện lợi khi đưa vào chế biến thành sãn phẫm khác như trường hợp chế biến bắp thành nhiên liệu (Improved manufacturing processes - decreasing water, electricity, and natural gas used to make biofuel from biotech corn) , v.v...

Thành phần cấu tạo trong DNA của thân cây có GMO không khác với DNA của thân cây không có GMO.Nhưng cách sắp xếp DNA sequence có đổi khác tuỳ theo phương pháp xử dụng như sau.

-Gene mới được đưa vào thân cây.

-Xóa bỏ một base pair trong gene.

-Thay đổi vị trí của gene trong chromosome.

-Thay đổi cấu tạo của những bộ phận có nhiệm vụ điều chỉnh sự hoạt động của gene (regulates the gene’s expression).

-Thay đổi DNA để gene chỉ hoạt động trong môt phần nào đó của thân cây (gene is only expressed in one certain part of the plant).

4-KỄT QUẢ ĐÃ THU HỌACH HIỆN NAY.

Hiện nay tại USA đã có trồng những cây GMO sau đây:

Alfalfa, apples, canola, corn (field and sweet), cotton, papaya, potatoes, soybeans, squash và sugar beets.

Về luật lệ, USA hiện nay KHÔNG BẮT BUỘC PHẢI CÓ NHẢN HIỆU đối với thực phẫm GMO hoặc thực phẫm có chứa chất GMO nghĩa là được bày bán chung với thực phẫm thiên nhiên. (GMO foods and foods with GMO ingredients are not requested under labels in US).

4-1-Danh sách tên các genes đã được chỉnh sửa bằng dụng cụ CRISPR-Cas9.

TRÍCH RA TỪ : https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-018-1586-y

Crop species	Gene editor	Target gene	DNA repair type	Target trait	Reference
Rice	CRISPR/Cas9	LAZY1	NHEJ	Tiller-spreading	[39]
Rice	CRISPR/Cas9	Gn1a, GS3, DEP1	NHEJ	Enhanced grain number, larger grain size and dense erect panicles	[40]
Wheat	CRISPR/Cas9	GW2	NHEJ	Increased grain weight and protein content	[41]
Camelina sativa	CRISPR/Cas9	FAD2	NHEJ	Decreased polyunsaturated fatty acids	[42]
Rice	CRISPR/Cas9	SBEIIb	NHEJ	High amylose content	[43]
Maize	CRISPR/Cas9	Wx1	NHEJ	High amylopectin content	[44]
Potato	CRISPR/Cas9	Wx1	NHEJ	High amylopectin content	[45]
Wheat	CRISPR/Cas9	EDR1	NHEJ	Powdery mildew resistance	[46]
Rice	CRISPR/Cas9	OsERF922	NHEJ	Enhanced rice blast resistance	[47]
Rice	CRISPR/Cas9	OsSWEET13	NHEJ	Bacterial blight resistance	[48]
Tomato	CRISPR/Cas9	SlMLO1	NHEJ	Powdery mildew resistance	[49]
Tomato	CRISPR/Cas9	SlJAZ2	NHEJ	Bacterial speck resistance	[50]
Grapefruit	CRISPR/Cas9	CsLOB1 promoter	NHEJ	Alleviated citrus canker	[51]
Orange	CRISPR/Cas9	CsLOB1 promoter	NHEJ	Citrus canker resistance	[52]
Grapefruit	CRISPR/Cas9	CsLOB1	NHEJ	Citrus canker resistance	[53]
Cucumber	CRISPR/Cas9	eIF4E	NHEJ	Virus resistance	[54]
Mushroom	CRISPR/Cas9	PPO	NHEJ	Anti-browning phenotype	[55]
Tomato	CRISPR/Cas9	SP5G	NHEJ	Earlier harvest time	[56]
Tomato	CRISPR/Cas9	SlAGL6	NHEJ	Parthenocarpy	[57]
Maize	CRISPR/Cas9	TMS5	NHEJ	Thermosensitive male-sterile	[58]
Rice	CRISPR/Cas9	OsMATL	NHEJ	Induction of haploid plants	[59]
Tomato	CRISPR/Cas9	SP, SP5G, CLV3, WUS, GGP1	NHEJ	Tomato domestication	[60]
Rice	CRISPR/Cas9	ALS	HR	Herbicide resistance	[61]
Rice	CRISPR/Cas9	ALS	HR	Herbicide resistance	[62]
Rice	CRISPR/Cas9	EPSPS	NHEJ	Herbicide resistance	[63]
Rice	CRISPR/Cas9	ALS	HR	Herbicide resistance	[64]
Soybean	CRISPR/Cas9	ALS	HR	Herbicide resistance	[65]
Maize	CRISPR/Cas9	ALS	HR	Herbicide resistance	[66]
Potato	CRISPR/Cas9	ALS	HR	Herbicide resistance	[67]
Flax	CRISPR/Cas9	EPSPS	HR	Herbicide resistance	[68]
Cassava	CRISPR/Cas9	EPSPS	HR	Herbicide resistance	[69]
Maize	CRISPR/Cas9	ARGOS8	HR	Drought stress tolerance	[70]

4-2-Tạo giống cà chua có trái ngắn ngày.

Gene làm cà chua có trái ngắn ngày hay nhiều ngày.

Cà chua có tên khoa học là Solanum lycopersicum cần nhiêu ngày mới có trái.

Còn cà chua có tên Solanum pimpinellifolium, thuộc loại ngắn ngaỳ tìm thấy ở vùng Andean Nam Mỹ Châu ,

Các khoa học gia đã tìm thấy gene tạo ra hoa của cà chua Solanum lycopersicum nầm trong chromosome 5 và đặt tên SP5G protein SELF PRUNING 5G ( Gene ID: 101254900, updated on 22-Dec-2018).

Sau khi trồng được 40-50 ngày thì cây cà chua (Solanum lycopersicum ) bắt đầu cho trái.và cần 20-30 ngày nữa để cho cà chua chín.

Vậy kể từ lúc bắt đầu trồng cây cà chua tới lúc có trái cà chua chín đỏ cần phải co 60-80 ngày.

Nhưng nhà vườn muốn có cà chua trồng ngắn ngày nên các khoa học gia Genetic Engineers đã xở dụng CRISPR-Cas9 để chỉnh sừa gene SP5G (SELF-PRUNING 5G) trong DNA của cà chua.

Gene SP5G nầy phụ trách cho hoa và quả cà chua.

Các nhà nghên cứu (Professor Zachary Lippman and his colleagues at Cold Spring Harbor Laboratory,NY,USA)đã tìm thấy rỏ gene SP5G tạo ra florigen hormone và anti- florigen hormone .

Chính anti- florigen hormone giử nhiệm vụ làm thay đổi thời gian cho hoa và quả cà chua. (Regulate flowering time).

Khi anti-florigen hormone nhiều thi cà chua cho hoa quả chậm. Lượng anti-florigen hormone thay đổi theo quang lượng của mặt trời.Ngày dài thì lượng anti-florigen hormone xuât hiện nhiều nên cà chua chậm cho ra hoa .

Đó là kêt luận sau khi trắc nghiệm như sau.

Ngày và đêm tại Galapagos Islands gần xích dài 12 tiếng đồng hồ. Ngày muà hè tại New York lâu14 tiêng đồng hồ.

Đem cà chua của đảo Galapagos trồng tại New York vào muà hè.Thí nghiệm cho biết cà chua trồng tại New York cho hoa và trái it hơn và chậm hơn.

còn tiếp

WELCOME TO BLOGGER VQGĐC

Thursday, December 20, 2018

CRISPR-Cas9 CẮT NỐI DNA CỦA SINH VẬT