DỤNG CỤ CRISPR-Cas9 CẮT NỐI DNA CỦA SINH VẬT
I-CRISPR-Cas9 (đọc "crisper") là chữ
viết tắt của câu “Clustered
Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”
diễn tả hình thức sắp xếp DNA sequences của 50%
vi khuẩn (50% bacteria) và 90% vi khuẫn cỗ ( 90% archae).
Các nucleotides
trong DNA của vi khuẩn sắp xếp theo khoảng cách bằng nhau và lặp lại đều đặng. Ở giửa 2
nucleotides có một khỏang trống (spacer) bằng nhau.
HÌNH 1 |
Vi
khuẩn là sinh vật rất nhỏ bé sinh tồn được nhờ protein do những genes
của nó tạo ra ,và có hệ thống miễn nhiễm để tự bảo vệ khi bị các
virus tấn công sát hại .
Nhà
sinh vất học Nhật Bản Yoshizumi Ish là người đầu tiên đã tìm thấy trong DNA của vi khuẩn E.Coli có 29 nucleotide repeat sequence với 32
nucleotide spacing vào năm 1987.
Năm 2002, Ruud Jansen (Utrecht University) chọn tên Clustered
Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats viết tắt CRISPR để ám chỉ vi khuẩn .
Nhưng
mãi tới năm 2007, CRISPR mới được công nhận bởi Rodolphe Barrangou( Associate Professor, CRISPR Lab
Lead).
Trong DNA của vi khuẩn có nhiều cas genes
để tạo ra protein nhưng các
khoa học gia chỉ chú trọng xử dụng
cas9 protein
của recombinant Streptococcus pyogenes Cas9
protein tinh lọc vì có nhiều ưu điểm hơn hết.
HÌNH 2 |
II- Thành phần và cách chế tạo CRISPR/Cas9
Cas9 protein tự
nó thì bất động nhưng nếu kết hợp với gRNA(guide-RNA) thì cas9 protein
chuyển đổi thành dạng three-dimensional structure có tính chất cắt bỏ và phá huỷ DNA của sinh thể ngoại nhập theo ý muốn của chúng ta. eo ý muốn của chúng ta..
Trong CRISPR/Cas9 chỉ
co 2 thành phần là Cas9 protein và
guide RNA (gRNA hoặc sgRNA). sgRNA nghĩa
là single guide RNA.
HÌNH 3 |
1-Chế tạo Cas9 protein.
Cas9 là
recombinant Streptococcus pyogenes Cas9
protein tinh lọc dùng
để cắt đôi dây DNA của sinh thể
ngọai nhập nhờ sgRNA dẫn tới địa điểm chúng ta muốn cắt bỏ. Nêu không có sgRNA thi Cas9 không họat động.
Cas9 protein còn được goị là Cas9 Nuclease mua từ các
công ty chế tạo có bán sẳn.
2- Tự thiết kế single
guide RNA (sgRNA) gồm có 20 nucleotides sequence.
sgRNA nói cho Cas9 protein biết phải cắt bỏ chổ
nào trên DNA để thay thế cái gene mà chúng ta muốn có.
Đó là một dây đơn độc do
chúng ta tự thiết kế gồm có 20 nucleotides goị
là single guide RNA (sgRNA) dùng để bám vào chỗ DNA mà chúng ta muốn cắt bỏ. sgRNA chí có
20 bases mà thôi.
Chổ muốn cắt bỏ phải có 23 bases . Khởi đầu từ “CC” và chấm dứt trong “GG”. Xem hình 3,4 và 5
PAM site là chổ của 3 bases có tên NCC
và NGG
trên mỗi dây nhắm tới nhưng không có trong sgRNA. Base N là tên của
base naò cũng được.
Thí dụ PAM : ACC và TGG
|
HÌNH 4 |
Muốn cho Cas9 protein của vi khuẩn S. pyogenes, cắt chính xác thì cần phải có PAM (protospacer adjacent motif) .
Nếu Cas9 protein không thấy có PAM cận kề mục tiêu trên DNA thì nó không cắt .
Đây là một thí dụ sgRNA sequence gôm có 20
nucleotides
5’ G AAC CGG TGC CTA GAG AAG G
Chúng ta có thể tự tăng thêm số nucleotides của gRNA
nếu muốn cắt một
đọan dài của DNA.Do đó trên hình
vẽ số 3, chúng ta thấy gRNA có một đọan gấp
xếp.
HÌNH 5 |
III - NHỮNG BƯỚC HỌAT ĐỘNG CỦA CRISPR–Cas9
·
Cas9 trộn chung với gRNA
·
Cas9/gRNA tìm trên DNA của sinh thể xâm nhập một khúc
giống hệt với gRNA
·
Cas9 cắt bỏ DNA xâm nhập.
·
Tế
bào tự chửa chổ bị cắt và đem nối vào chổ đó nucleotides mà chúng
ta muốn thay thế .
·
Tế bào có DNA sequence mới.
IV-THỰC HÀNH
THÍ NGHIỆM
Mua của công ty
NEW ENGLAND BIOLABS những món sgRNA (NEB #E2050), Cas9
protein(NEB #M0386S ), NEBuffer , Proteinase K(NEB #P8107S) và substrate DNA.
Làm trắc nghiệm theo hướng dẫn của
nhà chế tạo như sau.
1-Pha
chế 300 nM sgRNA =
300 nM sgRNA +20 µl H2O+ 3 µl NEBuffer
2-Lấy
1 µM Cas9 Nuclease, S. pyogenes (#M0386)
3-Trộn 1 và 2 với nhau rồi hấp ở nhiệt độ 25C trong 10 phút.
4-Lấy 30 nM substrate DNA có chứa chổ chúng
ta muốn cắt bỏ.
5-Sau đó thực
hiện như sau theo hướng dẫn của “New England Biolabs”
“Mix thoroughly and pulse-spin in a microfuge.
Incubate at
37°C for 15 minutes.
Add 1 μl of Proteinase
K(NEB #P8107S) to each sample, Mix thoroughly and pulse-spin in a
microfuge.
Incubate at room temperature for 10 minutes.
Proceed with fragment analysis.”
V-ÁP DỤNG CRISPR-Cas9 ĐỂ TẠO GIÔNG MỚI
1-NHIỆM VỤ CỦA GENE.
Gene là
một vùng của genome.Phân tích mỗi gene thấy có 3 thành phần quan
trọng là promoter, coding region và terminator có nhiệm
vụ khác nhau.
1-1-
Thứ nhứt là Coding
region chứa đựng những hướng dẫn tạo protein
(Contains the instructions for making a protein).
1-2-Thứ
hai là vùng gọị là promoter lo nhiệm vụ khởi động gene mở và đóng,
Promoter có thể dài 100–1000 base pairs tìm thấy ở gần start site (TSS ) của gene .
1-3-Thứ ba là terminator có
nhiệm vụ chấm dứt transcription của
gene.
Ngoài ra DNA còn có :
Enhancer
ở xa gene là một DNA sequence có nhiệm vụ làm gia tăng transcription của
gene (Enhances transcription)
Transcription factor hoặc có tên sequence-specific DNA-binding factor là một loại protein có nhiệm vụ nối kết các DNA sequences nên nó
cũng điều khiển mức độ truyền đạt transcription của gene.
Do đó promoters , enhancers và transcription factor làm nhiệm vụ
điều khiển mức độ truyền đạt transcription
từ DNA tới mRNA ( Regulate genetic transcription)
2-TÌM TÊN CỦA GENES Ở ĐÂU?
Thí dụ tìm genes của cây nho Vitis
vinifera .
Tên và vị trí của các genes (trong chromosomes) gom góp
từ nhiều kết quả nghiên cứu của các chuyên viên môn sinh học từ xưa
tới nay được tồn trử tại :
2-1-NCBI ( National
Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).
2-2- Ensembl (www.ensembl.org).
2-3- UCSC.
Theo kết quả nghiên cứu cho biết gene nằm bên cạnh PAM. Vậy chổ nào
có PAM
thì bên cạnh có gene.
Cây nho có tên khoa học là Vitis
vinifera hiện
nay được trồng nhiều nhất vì lợi ích
kinh tế, có genome dài khoảng 500
Mbp(Million base pairs), chứa khoảng 26,346 genes.Mỗi gene dài trung bình
3,6 base pairs
Nhóm nghiên cứu trong Website https://bmcplantbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12870-016...
cho biết :
“Trong cây nho có 5 loại PAM
: TGG, AGG, GGG, CGG và NGG.
Bốn loại PAM TGG, AGG, GGG
và CGG
đều có trong tất cả các chromosomes của cây
nho nhưng TGG xuất hiên nhiều nhất.”
Harvard University có phổ biến một website software giúp chúng ta tìm PAM có tên là https://igtrcn.org/chopchop-v2-improved-online-crisprcas9-target.
3-PHƯƠNG PHÁP
THAY ĐỔI GENE TẠO RA THÂN CÂY GMO(Genetically Modified Organisms)..
Sau khi hiểu rỏ thành phần cấu tạo và nhiệm
vụ của gene, nhà nghiên cứu tự lựa chọn phương pháp làm thay đổi
gene.
Nhứng cây được tạo ra do thay đổi gene theo ý
muốn của chúng ta được gọi cây GMO(Genetically
Modified Organisms).
Tại sao cần có những cây GMO?
Cây GMO có
nhiều ưu điểm như chống lại sự phá hại của côn trùng, cho
năng xuất cao, chịu đựng được khô hạn ,không cần thuỗc sát trùng nên
tránh ô nhiểm môi trường, tiết kiệm phí tổn trồng trọt ,binh
thân cây không xuất hiện, phẫm chất dinh dưởng cao,rất tiện lợi khi đưa vào chế biến thành
sãn phẫm khác như trường hợp chế biến bắp thành nhiên liệu (Improved manufacturing processes -
decreasing water, electricity, and natural gas used to make biofuel from
biotech corn) , v.v...
Thành phần cấu tạo trong DNA của thân cây có GMO không khác với DNA của thân cây
không có GMO.Nhưng cách sắp xếp
DNA sequence có đổi khác tuỳ theo phương pháp xử dụng như sau.
-Gene mới được đưa vào thân cây.
-Xóa bỏ một base pair trong gene.
-Thay đổi vị trí của gene trong chromosome.
-Thay đổi cấu tạo của những bộ phận có nhiệm
vụ điều chỉnh sự hoạt động của gene (regulates
the gene’s expression).
-Thay đổi DNA để gene chỉ hoạt động trong môt phần nào đó của thân cây
(gene
is only expressed
in one
certain part of the plant).
4-KỄT
QUẢ ĐÃ THU HỌACH HIỆN NAY.
Hiện nay tại USA
đã có trồng những cây GMO sau
đây:
Alfalfa, apples, canola, corn (field and
sweet), cotton, papaya, potatoes, soybeans, squash và sugar beets.
Về luật lệ, USA
hiện nay KHÔNG BẮT BUỘC PHẢI CÓ NHẢN HIỆU
đối với thực phẫm GMO hoặc thực phẫm
có chứa chất GMO nghĩa là được bày
bán chung với thực phẫm thiên nhiên. (GMO
foods and foods with GMO ingredients are not requested under labels in US).
4-1-Danh sách
tên các genes đã được chỉnh sửa bằng dụng cụ CRISPR-Cas9.
Crop
species
|
Gene
editor
|
Target
gene
|
DNA repair
type
|
Target
trait
|
Reference
|
Rice
|
CRISPR/Cas9
|
LAZY1
|
NHEJ
|
Tiller-spreading
|
[39]
|
Rice
|
CRISPR/Cas9
|
Gn1a, GS3,
DEP1
|
NHEJ
|
Enhanced
grain number, larger grain size and dense erect panicles
|
[40]
|
Wheat
|
CRISPR/Cas9
|
GW2
|
NHEJ
|
Increased
grain weight and protein content
|
[41]
|
Camelina
sativa
|
CRISPR/Cas9
|
FAD2
|
NHEJ
|
Decreased
polyunsaturated fatty acids
|
[42]
|
Rice
|
CRISPR/Cas9
|
SBEIIb
|
NHEJ
|
High
amylose content
|
[43]
|
Maize
|
CRISPR/Cas9
|
Wx1
|
NHEJ
|
High
amylopectin content
|
[44]
|
Potato
|
CRISPR/Cas9
|
Wx1
|
NHEJ
|
High
amylopectin content
|
[45]
|
Wheat
|
CRISPR/Cas9
|
EDR1
|
NHEJ
|
Powdery
mildew resistance
|
[46]
|
Rice
|
CRISPR/Cas9
|
OsERF922
|
NHEJ
|
Enhanced
rice blast resistance
|
[47]
|
Rice
|
CRISPR/Cas9
|
OsSWEET13
|
NHEJ
|
Bacterial
blight resistance
|
[48]
|
Tomato
|
CRISPR/Cas9
|
SlMLO1
|
NHEJ
|
Powdery
mildew resistance
|
[49]
|
Tomato
|
CRISPR/Cas9
|
SlJAZ2
|
NHEJ
|
Bacterial
speck resistance
|
[50]
|
Grapefruit
|
CRISPR/Cas9
|
CsLOB1
promoter
|
NHEJ
|
Alleviated
citrus canker
|
[51]
|
Orange
|
CRISPR/Cas9
|
CsLOB1
promoter
|
NHEJ
|
Citrus
canker resistance
|
[52]
|
Grapefruit
|
CRISPR/Cas9
|
CsLOB1
|
NHEJ
|
Citrus
canker resistance
|
[53]
|
Cucumber
|
CRISPR/Cas9
|
eIF4E
|
NHEJ
|
Virus
resistance
|
[54]
|
Mushroom
|
CRISPR/Cas9
|
PPO
|
NHEJ
|
Anti-browning
phenotype
|
[55]
|
Tomato
|
CRISPR/Cas9
|
SP5G
|
NHEJ
|
Earlier
harvest time
|
[56]
|
Tomato
|
CRISPR/Cas9
|
SlAGL6
|
NHEJ
|
Parthenocarpy
|
[57]
|
Maize
|
CRISPR/Cas9
|
TMS5
|
NHEJ
|
Thermosensitive
male-sterile
|
[58]
|
Rice
|
CRISPR/Cas9
|
OsMATL
|
NHEJ
|
Induction
of haploid plants
|
[59]
|
Tomato
|
CRISPR/Cas9
|
SP, SP5G, CLV3,
WUS, GGP1
|
NHEJ
|
Tomato
domestication
|
[60]
|
Rice
|
CRISPR/Cas9
|
ALS
|
HR
|
Herbicide
resistance
|
[61]
|
Rice
|
CRISPR/Cas9
|
ALS
|
HR
|
Herbicide
resistance
|
[62]
|
Rice
|
CRISPR/Cas9
|
EPSPS
|
NHEJ
|
Herbicide
resistance
|
[63]
|
Rice
|
CRISPR/Cas9
|
ALS
|
HR
|
Herbicide
resistance
|
[64]
|
Soybean
|
CRISPR/Cas9
|
ALS
|
HR
|
Herbicide
resistance
|
[65]
|
Maize
|
CRISPR/Cas9
|
ALS
|
HR
|
Herbicide
resistance
|
[66]
|
Potato
|
CRISPR/Cas9
|
ALS
|
HR
|
Herbicide
resistance
|
[67]
|
Flax
|
CRISPR/Cas9
|
EPSPS
|
HR
|
Herbicide
resistance
|
[68]
|
Cassava
|
CRISPR/Cas9
|
EPSPS
|
HR
|
Herbicide
resistance
|
[69]
|
Maize
|
CRISPR/Cas9
|
ARGOS8
|
HR
|
Drought
stress tolerance
|
4-2-Tạo giống
cà chua có trái ngắn ngày.
Gene làm cà
chua có trái ngắn ngày hay nhiều ngày.
Cà chua có tên khoa học
là Solanum
lycopersicum
cần nhiêu ngày mới có trái.
Còn
cà chua có tên Solanum pimpinellifolium, thuộc loại ngắn ngaỳ tìm
thấy ở vùng Andean Nam Mỹ Châu ,
Các khoa học gia đã tìm thấy gene tạo
ra hoa của cà chua Solanum lycopersicum
nầm trong chromosome 5 và đặt tên
SP5G protein SELF PRUNING 5G ( Gene ID: 101254900, updated on 22-Dec-2018).
Sau
khi trồng được 40-50 ngày thì
cây cà chua (Solanum
lycopersicum ) bắt đầu cho
trái.và cần 20-30 ngày nữa để cho cà
chua chín.
Vậy
kể từ lúc bắt đầu trồng cây cà chua tới lúc có trái cà chua chín
đỏ cần phải co 60-80 ngày.
Nhưng
nhà vườn muốn có cà chua trồng ngắn ngày nên các khoa học gia Genetic
Engineers đã xở dụng CRISPR-Cas9 để
chỉnh sừa gene SP5G (SELF-PRUNING 5G) trong DNA
của cà chua.
Gene SP5G nầy phụ trách cho hoa và quả cà chua.
Các nhà nghên cứu (Professor Zachary Lippman and his colleagues
at Cold Spring Harbor
Laboratory,NY,USA)đã tìm thấy rỏ gene SP5G tạo ra florigen hormone và anti- florigen hormone
.
Chính anti- florigen hormone giử nhiệm vụ làm thay đổi thời gian cho hoa và quả cà chua. (Regulate flowering time).
Khi anti-florigen
hormone nhiều thi cà chua
cho hoa quả chậm. Lượng anti-florigen hormone thay đổi theo quang lượng của mặt
trời.Ngày dài thì lượng anti-florigen
hormone xuât hiện nhiều nên cà chua chậm cho ra hoa .
Đó là kêt luận sau
khi trắc nghiệm như sau.
Ngày và đêm tại Galapagos
Islands gần xích dài 12 tiếng đồng hồ. Ngày muà hè tại New York lâu14 tiêng đồng hồ.
Đem cà chua của đảo Galapagos trồng tại New York vào muà hè.Thí
nghiệm cho biết cà chua trồng tại New York cho hoa và trái it hơn và chậm hơn.
còn tiếp