TÌM HIỂU SƠ LƯỢC CÁCH CẮT NỐI DNA

SƠ LƯỢC PHƯƠNG PHÁP CẤT NỐI DNA

1-DNA LÀ GÌ?

Vào năm 1951, ba khoa học gia James Watson (b. 1928), Francis  Crick (1916-2004) và Maurice Wilkins (1916-2004) tại University Cambridge,UK đã xác định rỏ rệt cấu trúc (structure) của DNA (Deoxyribonucleic Acid) nhờ xử dụng hình chụp X-ray, kết hợp với hình ba chiều của acid nên được giải Nobel năm 1962. . Đây là một sự khám phá vĩ đại cho nhân loại vì đã tìm được chỗ chứa đựng bí mật của sự sống mà nhân loại gọi là The secret of life.

(Người đã chụp hình DNA bằng máy X-ray là kỹ sư họa học ROSALIND FRANKLIN (1920-1958) từ trần vì bịnh ung thư trước ngày phát thưởng Nobel nên không được lảnh thưởng)

2-TIÊU CHUẨN LÀM CODING DNA

3-DỤNG CỤ CẮT NỐI DNA

3-CHÚ Ý TRƯỚC KHI THỰC HÀNH CẮT MỘT DNA

·        Cas9 trộn chung với sgRNA. sgRNA nghĩa là single guide RNA.

·        Cas9 có nhiệm vụ cắt bỏ DNA của sinh thể xâm nhập.

·        Tế bào tự chửa chổ bị cắt và đem nối vào chổ đó nucleotides mà chúng ta muốn thay thế thì tế bào sẽ có DNA sequence mới.

 sgRNA có nhiệm vụ dẫn tới địa điểm chúng ta muốn cắt bỏ. Nêu không có sgRNA thi Cas9 không cắt.

sgRNA chí có 20 bases mà thôi và sẽ tìm trên DNA một đọan giống hệt nó. Mua sgRNA từ công ty chế tạo .

Cas9 protein còn được goị là Cas9 Nuclease,  mua từ các công ty chế tạo .

Chổ muốn cắt bỏ phải có 23 bases .  Khởi đầu từ “CC” và chấm dứt trong  “GG”.

Muốn cho Cas9 protein của vi khuẩn S. pyogenes, cắt chính xác thì cần phải có PAM (protospacer adjacent motif) .

Nếu Cas9 protein không thấy có PAM cận kề mục tiêu trên DNA thì nó không cắt .

PAM là chổ của  3 bases có tên NCC và NGG trên mỗi dây DNA nhưng không có trong sgRNA. Base N là tên của base naò cũng được.

Thí dụ PAM : ACC và TGG

 

Mua của công ty NEW ENGLAND BIOLABS những món sgRNA (NEB #E2050), Cas9 protein(NEB #M0386S ), NEBuffer , Proteinase K(NEB #P8107S) và substrate DNA.

 Làm trắc nghiệm theo hướng dẫn của nhà chế tạo như sau.

1-Pha chế 300 nM sgRNA  = 300 nM sgRNA +20 µl H2O+ 3 µl NEBuffer

2-Lấy 1 µM Cas9 Nuclease, S. pyogenes (#M0386)

3-Trộn 1 và 2  với nhau rồi hấp ở nhiệt độ 25C trong 10 phút.

4-Lấy 30 nM substrate DNA có chứa chổ chúng ta muốn cắt bỏ.

 5-Sau đó thực hiện như sau theo hướng dẫn của  “New England Biolabs”

TÌM AMINO ACID TRONG DNA

Start codon là ATG.Stop codon là TAA, TAG, TGA

Mỗi codon tạo ra một amino acid.

Thí dụ tìm số codons trong sequence nây.

GTGTATTTTGACCTACGAATTGG.

Có 3 cách đếm số codons để tim số amino acid.

 Cách thứ nhất bắt đầu từ chữ G: thấy có 7 codons như sau : GTG, TAT, TTT, GAC, CTA, CGA, ATT

 Cách thứ hai bắt đầu từ chữ T : thấy có 7 codons như sau: TGT, ATT, TTG, ACC, TAC, GAA,TTG

 Cách thư ba, bắt đầu từ chữ G thấy thấy có 7 codons như sau : GTA, TTT, TGA, CCT, ACG, AAT,TGG.

Tìm xem trong cách thứ ba nầy mắc dầu có 7 codons nhưng chỉ có 6 amino acid

Xem bảng liệt kê sau để biết những codons nào sẽ cho amino acid.

GTA : Valine, TTT : Phenylalanine, TGA : stop codon

CCT : Proline, ACG : Threonine, AAT : Asparagine

TGG : Tryptophan

 NHỮNG AMINO ACIDS ĐÃ TÌM THẤY TRONG CODONS .

 Ghép 3 chữ của 4 chữ A, C, G, T taọ ra được 64 codons chứa 20 amino acids có tên  như sau.

                                             

1-Phenylalanine  F     TTT, TTC

2-Methionine      M       ATG chọn làm Start codon

3-Cysteine           C       TGT, TGC

4-Alanine            A        GCT, GCC, GCA, GCG

5-Glycine              G       GGT, GGC, GGA, GGG

6-Isoleucine        I        ATT, ATC, ATA

7-Leucine              L      CTT, CTC, CTA, CTG, TTA, TTG

8-Valine                V    GTT, GTC, GTA, GTG

9-Proline             P    CCT, CCC, CCA, CCG

10-Threonine       T     ACT, ACC, ACA, ACG

11-Serine             S     TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC

12-Tyrosine          Y    TAT, TAC.

13-Tryptophan     W   TGG

14-Glutamine       Q    CAA, CAG

15-Asparagine      N    AAT, AAC

16-Histidine          H    CAT, CAC

17-Glutamic acid   E    GAA, GAG

18-Aspartic acid    D   GAT, GAC

19-Lysine               K    AAA, AAG

20-Arginine  R    CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG

Stop codons         Stop  TAA, TAG, TGA

                                 -

Quan sát bảng liệt kê trên , chúng ta thấy có nhiều amino acids chiếm hơn một codon.

4-OPEN READING FRAME (ORF) LÀ GÌ ?

Muốn tìm gene trong DNA,chúng ta cằn biết trình tự sắp xếp các nuclêotides giứa start codon (atg) và stop codons (taa, tag, tga) của gene.

Những nucleotides ở trong khoảng cách giữa hai codons đó được goị là OPEN READING FRAME OF GENE.

Với bất cứ phần nào trên DNA, chúng ta có thế tạo được 3 ORF theo chiều forward và 3 ORF theo chiều ngược lại.

Đọc ORF chúng ta biết tên của những amino acid do gene tạo ra. 

Thí dụ đây là một DNA.

5'                                                              3'
 atgcccaagctgaatagcgtagaggggttttcatcatttgaggacgatgtataa